Vereniging Oud Medische Stafleden CWZ

Abstract Microbiologie in de hoogste versnelling.

dr. Corné H.W. Klaassen, moleculair bioloog CWZ . 2 November 2011

Sinds 12 jaar is er een moleculair bioloog in het CWZ vnl. op de afdeling microbiologie, maar ook op het KCL. De afdeling microbiologie omvat 4 subafdelingen: bacteriologie, serologie, mycologie en moleculaire biologie.

Grofweg zijn de bepalingen in 3 categorien in te delen: detectie, identificatie en typering van bacteriën (b), schimmels (s), parasieten (p) en virussen (v). Detectie door kweek (bsv), microscopie (bsp), antilichaam-(bspv), antigeentesten (bspv). Identificatie door microscopie (bsp), bonte rij (bs): groei op bepaalde substraten, AP1 (bs): kant en klare testkits, specifieke antigeentesten (bv): bijv. coli en shigella bevatten in de cel-wand specifieke antigenen, cyto- pathologisch effect (v), neutraliserende antilichamen (v). Typering/ karakterisatie: vooral bedoeld om onderscheid te maken tussen verschillende individuen binnen één soort door: antibiogram (bs), pulsed field gel electroforese= PFGE (b), antigeentesten (bv). De klassieke methoden hebben nogal wat beperkingen : sensitiviteit, specificiteit, bewerkelijkheid (workload), snelheid, kosten. Zo moeten mycobacteriën vaak 6 weken op kweek.

De Polymere Chain Reactie (PCR): DNA bevat 2 strengen, die loslaten door verhitting. Ver-dubbeling van de DNA ketens kan door specifiek DNA (commercieel verkrijgbaar primertje) erbij te doen. Deze verdubbeling kan steeds herhaald worden, waardoor er miljarden DNA ketens ontstaan, die geanalyseerd kunnen worden.
Voordelen: Kweek niet meer nodig, duurt maar 3 uur, extreem gevoelig, extreem verschillen-de toepassingen mogelijk. Nadelen: Je vindt alleen wat je zoekt, risico op contaminatie van andere monsters. De reactie kan ook in real-time uitgevoerd worden door een DNA-probe met een fluorescente groep te gebruiken en de graad van fluorescentie te meten met behulp van o.a. een LightCycler: eerder fluorescentie betekent een grotere hoeveelheid bacteriën. Dus detectie, identificatie en kwantificering binnen 40 minuten!! Sterke reductie contaminatierisico aangezien er na amplificatie niet meer met het DNA gewerkt hoeft te worden.

Recente ontwikkelingen op DNA gebied: o.a. Multilocus sequence typing. Hiermede kunnen variabelen op meerdere loci in het DNA worden opgespoord. De sequentietypen kunnen door een nummering wereldwijd worden gecommuniceerd.
Microsatelliet typering: Afgekeken uit de forensische diagnostiek en steeds vaker ingezet in de microbiologie. Van microsatellieten kunnen de aantallen herhalingen van repeterende elementen worden bepaald door capillaire electroforese voor meerdere loci tegelijk.
Andere moleculaire applicaties: moleculair voorspellen van antibiotica/antimycotica gevoeligheid, typeren op basis van real-time PCR, analyseren van het totale genoom van een bacterie in een paar uur tijd. In 1 analyse kunnen 100 miljard basen (= 100 Gbasen) worden gelezen. Dit levert problemen van een hele andere omvang op o.a. met de data-analyse!

Recente ontwikkelingen die niet op DNA technieken gebaseerd zijn: o.a. Maldi-TOF. Met laser schieten op monster, waardoor eiwitten worden geïoniseerd. Op grond van de tijd, die deze over een bepaalde afstand afleggen, kan de grootte worden bepaald. Zodoende worden eiwitspectra verkregen die specifiek voor een bacteriesoort zijn. Uitermate snel (seconden …) èn goedkoop (nauwelijks reagentia nodig).