CRISPR-Cas

2 oktober 2019

Eind 2018 ontstond er opschudding toen bekend werd dat de eerste genetisch gemodificeerde baby’s geboren waren. MIT Technology Review had de primeur. De onderzoeker dr. He bevestigde de claim.

Wat had hij gedaan? Aan Shenzhen Universiteit zijn paren gerekruteerd waarvan de man HIV positief is. Via IVF zijn de eicellen bevrucht, waarna de embryo’s genetisch gemodificeerd zijn met een techniek die CRISPR-Cas wordt genoemd.

De genetische modificatie vond plaats aan het gen coderend voor de CCR5 receptor. Deze receptor geeft samen met de CD4 receptor op lymfocyten het HIV virus toegang tot de cellen met alle gevolgen van dien. Er bestaat een mutatie van deze receptor die resistentie tegen HIV infectie biedt. Het veranderen van het CCR5 gen was het doel. Overigens komt deze mutatie vrijwel alleen voor bij Europeanen en is er een noord-zuid gradiënt; er wordt gespeculeerd of dit allel verspreidt is door de Vikingen.

Terug naar de basis. Hoe werkt ons genetisch materiaal en daarna de geschiedenis van CRISPR-Cas. Ons erfelijk materiaal is opgeslagen in de chromosomen in de celkern. De chromosomen zijn opgebouwd uit twee lange strengen nucleotiden in de vorm van een dubbele helix, groepen nucleotiden vormen genen coderend voor een specifieke eiwit.

Hoe wordt de genetische informatie vertaald? Het DNA wordt overgeschreven naar RNA, dat wordt vertaald in een functioneel eiwit.

Er kunnen veranderingen in de DNA volgorde optreden met gunstig of ongunstig effect. Ongunstige effecten zijn mutaties leidend tot ziekte zoals FAP, sikkelcelziekte, thalassemie, cystic fibrosis. Al lang wordt geprobeerd een mutatie te repareren. Voor de komst van CRISPR-Cas was dit tijdrovend, complex, duur, onveilig en inefficiënt.

Wat is CRISPR-Cas en hoe is de ontwikkeling als gene-editing tool gegaan?

Voor alles is iemand te vinden die er zijn levenswerk van maakt. Zo ook bij Francisco Mojica die zijn tijd besteedde aan de structuur van halofielen, bacteriën die voorkomen in een omgeving met extreme zoutconcentraties zoals de zoutpannen van het Spaanse Santa Pola. Hij bestudeerde het DNA van Halofax mediterranei. Hierbij viel op dat er een gebied is met korte segmenten die herhaald worden en gescheiden zijn door spacers (1993-1995). Deze gebieden ontdekte hij bij meerdere bacterie soorten. Hieruit concludeert hij dat ze een belangrijke functie moeten hebben. Naam: clustered regularly interspaced short palindromic repeats.

De aard van deze gebieden werd pas duidelijk in 2002-2005. De DNA sequenties werden ingevoerd in het BLAST programma, een soort Google voor biomedici; deze bleken overeen te komen met dat van bacteriofagen.

Bacteriofagen zijn virussen die bacteriën aanvallen. Zij komen overal voor en overtreffen het aantal bacteriën met een factor 10. 40% van de bacteriën worden gedood door bacteriofagen.

Bacteriofagen zijn in de jaren van de eerste wereldoorlog ontdekt door Twort en d’Herelle. Zij zagen dat een bacterievrij filtraat van faeces van dysenterie patiënten in vitro en in vivo een helend effect had. Faeces van overlevers van dysenterie gaf een gunstig effect bij zieke patiënten.

Bacteriofagen kunnen verschillende vormen hebben, maar de meest bekende is die van een klein ruimtevoertuig dat landt op een bacterie, het DNA materiaal inspuit, leidend tot synthese van faag DNA en eiwit, waarna de bacterie lyseert met uitstoting van vele fagen.

In 2005 volgde het eureka moment van Mojica: CRISPR loci vormen een adaptief immuun systeem van bacteriën tegen faaginfecties, anders gezegd: met CRISPR kunnen bacteriën leren zich te verzetten tegen faaginfecties. Althans dat is dan zijn theorie.

In dezelfde tijd blijkt dat CRISPR niet eenzaam is maar altijd samen met een ander groep genen voorkomt: CRISPR-associated (Cas) genen.

Het vermoeden van Mojica wordt bewezen door Horvath. Dit onderzoek komt uit een logische, maar onverwachte hoek. Hij werkt bij Danisco, een Deense producent van onder meer yoghurt en kaas. Het werkpaard bij de productie hiervan is de Streptococcus thermophilus, die zorgt voor fermentatie. Het is van belang een stam te gebruiken die ongevoelig is voor faag infecties, zodat het fermentatieproces geen gevaar loopt.

Horvath ontdekte:

1. Faag sensitieve stammen missen CRISPR loci

2. Faag ongevoelige stammen hebben CRISPR loci

3. CRISPR loci van ongevoelige stammen bevatten faag DNA

4. Mutatie van CRISPR loci ter hoogte van een spacer = verlies immuniteit tegen faag

5. Cas nodig voor resistentie

Hoe inactiveert CRISPR-Cas de faag? CRISPR DNA gericht tegen een specifieke faag wordt vertaald naar CRISPR RNA, dat een complex vormt met de Cas eiwitten. Dit complex knipt het DNA van de binnen dringende faag precies op de plek die complementair is aan het CRISPR RNA. CRISPR-Cas is dus een geprogrammeerd knipenzym.

Dan gaat het snel. Siksnys, Doudna en Charpentier beschrijven in 2012 dat DNA in vitro specifiek geknipt kan worden door Cas in combinatie met een custom-designed crRNA. Zij vragen patent aan voor dit specifieke principe.

Zhang brengt de toepassing van dit mechanisme in 2013 op een hoger niveau: CRISPR-Cas kan gebruikt worden voor in vivo genome editing van zoogdiercellen. Ook hij patenteert dit principe. In hetzelfde nummer van Science publiceert Church over genome editing in menselijke cellen.

Naast selectie en mutatie is er nu dus nu een derde manier om de evolutie van levende wezens te beïnvloeden. Kort samengevat en sterk vereenvoudigd: wanneer je DNA van een levend wezen wilt veranderen dan maak “guide RNA” overeenkomstig het te bewerken stuk DNA, dit combineer je met Cas, waarna het genoom-DNA op de specifieke plaats wordt geknipt, hier kun je het bij laten, je kunt ook een stuk donor DNA invoegen. Je kunt zo genen uitschakelen of veranderen.

In de tussentijd is er een juridische strijd losgebarsten tussen Doudna/Charpentier = UC-Berkeley en Zhang (MIT/Broad) over het patent van CRISPR-Cas. Kern van de zaak is dat waar Doudna het mechanisme in vitro beschreef, Zhang het eerste in vivo werk verrichtte. MIT/Harvard heeft de patent oorlog vooralsnog gewonnen. Maar Doudna, Carpentier en in mindere mate Siksnys zijn wetenschappelijke supersterren geworden. De CRISPR industrie is een snel groeiende potentieel miljarden business geworden.

Beide partijen strijden niet alleen om het patent, maar ook om erkenning. Een review artikel in Cell van de hand van de directeur van het Broad instituut van MIT en Harvard valt slecht in Berkeley. Doudna schrijft haar eigen geschiedenis in de bestseller “A crack in creation”.

Toepassingen van deze techniek zijn als volgt onder te verdelen:

1. Genome editing van planten en dieren, met de volgende sprekende voorbeelden

a. Myostatine knock-out runderen

b. Hoornloze koeien

c. FGF5 knock-out cashmere geiten

2. Modificatie van humane embryo’s door genome editing

a. In combinatie met pre-implantatie genetische diagnostiek

3. Ex vivo genome editing van stamcellen, met name de hematopoietische stamcel

a. Bij de behandeling van sikkelcelanemie en thalassemie

4. In vivo modificatie van weefselcellen

a. Gen therapie bepaalde vorm van congenitale amaurosis (NB voorbeeld, geen CRISPR, maar andere gentechniek)

In al deze gevallen gaat het om het gericht repareren of gericht uitschakelen van genen.

Een laatste heel interessante toepassing is het overbrengen van eigenschappen middels gene drive. Stel je wilt malaria uitroeien niet door de parasiet aan te pakken, maar de gastheer, de mug. Er is een mutatie waardoor de mug geen gastheer van de parasiet kan zijn. Wanneer een aldus gemodificeerde mug in de populatie wordt gebracht dan verdunt deze modificatie heel snel. Stel nu dat je naast de modificatie ook het CRISPR-Cas gen inbouwt dat zelf opzoek gaat naar het stukje DNA waar de mutatie ingebouwd moet worden. Dan is het een kwestie van tijd voordat de gehele populatie voorzien is van de mutatie.

Tot slot dit. Het lijkt dat we met CRISPR-Cas een derde manier hebben gevonden om de evolutie genoom te beinvloeden. Dit naast natuurlijke selectie en mutatie. Maar effectiviteit en veiligheid zijn nog lang niet bewezen.

Voorbeeld beperkte effectiviteit op dit moment: NEJM september 2019.